Příliš mnoho šablony v pcr

Množství celkové DNA v PCR má výrazný vliv na výsledek postupu PCR. Použití příliš velkého množství celkové DNA vede k zabalení DNA do uzavřeného prostoru reakční nádoby a může vést k falešnému primingu a dokonce ke špatné syntéze DNA v důsledku blokované difúze velkých molekul Taq polymerázy.

1. Kolik šablony mám přidat do PCR?
2. Může příliš mnoho primeru inhibovat PCR?
3. Co může způsobit selhání reakce PCR?
4. Kolik DNA stačí na PCR?

Kolik šablony mám přidat do PCR?

I když by teoreticky stačila jedna molekula templátu, pro klasickou PCR se obvykle používá podstatně větší množství DNA, například až 1 µg genomové savčí DNA a pouhých 1 pg plazmidové DNA (1).

Může příliš mnoho primeru inhibovat PCR?

Kontaminanty ve směsi dNTP mohou vést k neúplné nebo nesprávné amplifikaci nebo inhibici PCR. Používejte vysoce kvalitní dNTP. Použití nadměrné koncentrace primerů může zvýšit šanci, že se primery nespecificky navážou na nežádoucí místa na šabloně nebo na sebe navzájem.

Co může způsobit selhání reakce PCR?

Zapomenutí pouze jedné složky reakce PCR, ať už jde o DNA polymerázu, primery nebo dokonce templátovou DNA, bude mít za následek neúspěšnou reakci. Nejjednodušším řešením je reakci zopakovat. ... Pokud ani poté produkt PCR neexistuje, je pravděpodobné, že vaší reakci brání něco jiného.

Kolik DNA stačí na PCR?

Při typické 50 µL reakci jsou k amplifikaci cílové DNA dostatečné 1–2 jednotky DNA polymerázy. Může však být nutné upravit množství enzymu obtížnými templáty. Pokud jsou například ve vzorku DNA přítomny inhibitory, zvýšení množství DNA polymerázy může zlepšit výtěžky PCR.