Problémy se zesílením Pcr

Odstraňování problémů s amplifikací PCR a RT-PCR

1. Co způsobuje selhání PCR?
2. Jak řešíte problém s PCR?
3. Co byste dělali, kdyby PCR amplifikace vzorku selhala?
4. Co se stane, když do PCR přidáte příliš mnoho primeru?

Co způsobuje selhání PCR?

Obvykle první věc, kterou vědci udělají, je obviňovat vadný enzym nebo činidlo, když experiment selže, ale u PCR je to ve skutečnosti méně pravděpodobné, že to bude příčinou neúspěchu. Častěji jsou příčinou hlubší vnitřní problémy, jako je design primeru, parametry termocykleru nebo nespecifická vazba na jiné templátové sekvence.

Jak řešíte problém s PCR?

Zkontrolujte schopnost délky amplifikace vybraných DNA polymeráz. Používejte DNA polymerázy speciálně určené pro dlouhou PCR. Vyberte DNA polymerázy s vysokou procesivitou, které mohou zesílit dlouhé cíle za kratší dobu. Snižte teploty žíhání a prodlužování, abyste napomohli vazbě primerů a termostabilitě enzymů.

Co byste dělali, kdyby PCR amplifikace vzorku selhala?

Pokud selhací reakce selže a máte podezření, že je templát DNA kontaminován inhibitorem, přidejte podezřelý přípravek DNA do kontrolní reakce s párem templátu DNA a primerů, který se v minulosti dobře amplifikoval .

Co se stane, když do PCR přidáte příliš mnoho primeru?

Použití vyšších koncentrací primerů může mít následující účinky: Pokud jsou primery schopné vytvářet dimery, zvýšení jejich koncentrace vede pouze k vytvoření primer-dimerů a nezlepšuje amplifikaci požadovaného produktu PCR.