Problémy se zesílením

1. Jaké problémy mohou vyplývat z amplifikace PCR?
2. Proč v PCR nedochází k amplifikaci?
3. Co způsobuje amplifikaci v PCR?
4. Co způsobuje selhání PCR?

Jaké problémy mohou vyplývat z amplifikace PCR?

Mnoho běžných problémů s PCR a RT-PCR je identifikováno během elektroforézy reakčních produktů na agarózovém gelu. Patří sem absence očekávaného amplifikačního produktu, přítomnost nespecifických produktů, nadměrné rozmazávání a přítomnost pásu „primer dimeru“.

Proč v PCR nedochází k amplifikaci?

Nefunguje enzym DNA polymeráza

Enzym DNA polymeráza je zodpovědný za prodloužení navázaných primerů podél templátových řetězců DNA. Pokud tento enzym již není tak účinný, možná v důsledku zmrazování a rozmrazování, pak krok prodloužení během reakce PCR bude neúplný, takže nebudete mít žádný produkt PCR.

Co způsobuje amplifikaci v PCR?

Základní PCR. Proces PCR byl původně vyvinut k amplifikaci krátkých segmentů delší molekuly DNA (Saiki et al. 1985). Typická amplifikační reakce zahrnuje cílovou DNA, termostabilní DNA polymerázu, dva oligonukleotidové primery, deoxynukleotid trifosfáty (dNTP), reakční pufr a hořčík.

Co způsobuje selhání PCR?

Obvykle první věc, kterou vědci udělají, je obviňovat vadný enzym nebo činidlo, když experiment selže, ale u PCR je to ve skutečnosti méně pravděpodobné, že to bude příčinou neúspěchu. Častěji jsou příčinou hlubší vnitřní problémy, jako je design primeru, parametry termocykleru nebo nespecifická vazba na jiné templátové sekvence.